La mobilité restreinte de groupes fonctionnels spécifiques réduit les

Jul 25, 2023

Rapports scientifiques volume 6, Numéro d'article : 22478 (2016) Citer cet article

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Les traitements anticancéreux les plus courants actuellement disponibles sont la radiothérapie et la chimiothérapie. Ces thérapies présentent cependant des inconvénients, tels que la diminution de la qualité de vie et la faible efficacité de la radiothérapie en cas de métastases multiples. Pour atténuer ces effets, nous avons encapsulé un médicament anticancéreux dans une matrice biocompatible. Des tests in vitro indiquent que ce bio-nanocomposite est capable d'interagir et de provoquer des changements morphologiques dans les cellules cancéreuses. Pendant ce temps, aucune altération n'a été observée dans les monocytes et les fibroblastes, indiquant que ce système pourrait transporter le médicament dans des organismes vivants avec un taux de clairance et une toxicité réduits. Des rayons X et des neutrons ont été utilisés pour étudier la structure porteuse, ainsi que pour évaluer la mobilité du médicament dans le bio-nanocomposite. À partir de ces données uniques, nous montrons que la restriction partielle de la mobilité des groupes actifs de la molécule médicamenteuse suggère pourquoi cette conception de support est potentiellement plus sûre pour les cellules saines.

Le cancer est l'un des principaux problèmes de santé publique dans le monde. En Europe, l'incidence de cette maladie est passée de 3,2 millions de nouveaux cas en 2008 à 3,45 millions en 2012, avec un taux de mortalité d'environ 50%1,2. Le paclitaxel (PTX) est l'un des médicaments les plus efficaces actuellement disponibles pour le traitement des cancers du sein, du poumon et de l'ovaire3,4,5,6. Sa fonction repose sur un mécanisme unique impliquant la stabilisation des microtubules cellulaires, ce qui explique son succès thérapeutique7. Cependant, des limitations considérables existent toujours concernant ce médicament, principalement en raison de sa faible solubilité dans l'eau (~ 0,4 μg/mL) et, bien sûr, de sa toxicité pour les cellules saines. Pour augmenter sa solubilité, un médicament est souvent formulé dans des solvants organiques, tels que l'éthanol déshydraté et l'huile de ricin polyoxyéthylée. Malheureusement, cette approche provoque de nombreux effets secondaires, tels que des réactions d'hypersensibilité et une hyperlipidémie8.

Par conséquent, le développement ou la modification de systèmes pour accueillir et délivrer des médicaments anticancéreux est de la plus haute importance9. Une alternative prometteuse est l'utilisation de nano-porteurs polymères solubles pour contrôler la pharmacocinétique et la biodistribution du médicament10. Le biopolymère chitosane, en particulier, a suscité un grand intérêt dans les applications biomédicales en raison de sa biocompatibilité et de sa biodégradabilité11. Ce chemin a également été utilisé comme matrice d'encapsulation pour PTX avec des résultats prometteurs12,13. D'autres améliorations peuvent être apportées en modifiant les caractéristiques de surface du système d'administration de médicament avec des composés à faible toxicité, ce qui peut également permettre d'augmenter l'adhérence du support aux cellules cancéreuses14. A cet effet, l'utilisation de l'hydroxyapatite (Ca10(PO4)6(OH)2, ci-après HAP), principal constituant inorganique des os et des dents humaines, est un excellent candidat. À l'échelle nanométrique, HAP présente une biocompatibilité particulière ainsi qu'une non-immunogénicité, un comportement non inflammatoire, une ostéoconductivité élevée et une bonne adhérence à différents types de cellules cancéreuses15,16. Plus intéressant encore, les nanoparticules HAP (nHAP) présentent un effet inhibiteur sur la prolifération des cellules cancéreuses avec des effets moindres sur les cellules saines16,17,18,19. Par conséquent, la combinaison des propriétés du nHAP avec des biopolymères dans un nanocomposite peut conduire à des systèmes d'administration de médicaments ayant des effets inhérents sur les cellules cancéreuses. Cependant, pour tirer pleinement parti des propriétés du nHAP, ces nanoparticules doivent se trouver dans la couche externe du composite20. En plus des avantages découlant de la combinaison d'un biopolymère avec nHAP, l'inclusion d'un médicament dans des nano-supports aux propriétés magnétiques, par exemple des nanoparticules de ferrite Mn-Zn, offre de nouvelles possibilités remarquables. Par exemple, guider le support de médicament le long du corps à l'aide d'un champ magnétique externe ainsi que surveiller sa position par des gradiomètres ou une imagerie par résonance magnétique21,22,23,24. Enfin, les traitements par hyperthermie magnétique, qui représentent une technique prometteuse utilisée en association avec la radio et la chimiothérapie, deviennent également praticables25,26,27.

Suivant les idées décrites ci-dessus, nous avons encapsulé la PTX dans un bio-nanocomposite (ci-après bio-NCP et bio-NCP + PTX) formé de nanoparticules de ferrite Mn-Zn recouvertes de chitosane, dont la surface a été modifiée avec nHAP28.

Des tests morphologiques in vitro, réalisés à l'aide de la microscopie électronique à balayage (SEM) et de la spectroscopie de rayons X à dispersion d'énergie (EDS), basés sur une méthodologie développée par notre groupe, ont permis d'avoir un aperçu préliminaire de l'interaction entre les cellules et les nanoparticules sans avoir besoin de des marqueurs fluorescents ou radioactifs dans les nanoparticules. Les résultats suggèrent que les monocytes normaux et deux types distincts de cellules tumorales interagissent différemment avec le bio-NCP. Alors qu'aucune toxicité n'a été observée sur les cellules saines, des changements morphologiques ont été détectés principalement dans les cellules cancéreuses du côlon.

La caractérisation plutôt difficile du bio-NCP + PTX formulé et la compréhension de la dynamique du médicament encapsulé et libéré ont été réalisées en utilisant respectivement des techniques avancées de microscopie et de spectroscopie. Celles-ci comprennent la spectroscopie à structure fine d'absorption des rayons X proche du bord (NEXAFS), la microscopie à rayons X à transmission par balayage (STXM) et la diffusion inélastique des neutrons (INS).

NEXAFS a permis de caractériser différents groupements organiques grâce à l'interaction des rayons X avec la couche K des atomes de carbone, sans que les nanoparticules magnétiques n'affectent le résultat29. En combinant NEXAFS avec STXM, la carte de composition chimique ainsi que l'analyse visuelle de la distribution PTX du bio-NCP ont été obtenues. Ces résultats indiquent que la PTX est distribuée dans la partie polymère du support.

Enfin, la comparaison de la dynamique du médicament encapsulé à celle de la forme pure, étape clé dans la compréhension et le contrôle des interactions polymère/médicament et l'une des questions majeures dans l'évolution de cette technologie vers des essais cliniques, a été obtenue par combinant INS avec les calculs de la théorie fonctionnelle de la densité (DFT). Ces résultats ont permis l'attribution des modes vibrationnels, y compris ceux observés au sein du transporteur de drogue30,31,32. En utilisant cette approche, nous montrons que bien que les modes vibrationnels phényle et acétyle soient contraints par l'encapsulation, ils semblent être récupérés après la libération du médicament. Ceci est important car l'activité PTX est connue pour être liée à la mobilité de ces groupes7.

Pour conclure, l'ensemble de nos résultats indique que le bio-NCP proposé peut ouvrir de nouvelles opportunités pour le domaine émergent de la délivrance de médicaments.

Le potentiel du bio-NCP en tant que porteur de PTX est mis en évidence par les tests in vitro avec des monocytes, qui tendent à favoriser la phagocytose des particules ou molécules étrangères dans le corps humain, les bloquant pour atteindre les tissus cibles.

Les changements morphologiques des monocytes d'un donneur sain (groupe témoin) (Fig. 1(a)) ont été évalués visuellement en réponse à leur contact pendant 2 h avec les nanoparticules de ferrite pure (Fig. 1(b)) et avec le bio-NCP (Fig. 1(c)) au moyen d'un MEB. Dans les deux cas, des changements morphologiques considérables n'ont pas été observés. Par la suite, les cellules ont été analysées par EDS afin de déterminer les régions à forte concentration en Fe, principal composant des nanoparticules de ferrite Mn-Zn qui composent le noyau du bio-NCP. Une telle observation donne un aperçu des interactions entre les cellules et les nanoparticules. C'est en effet le cas dans l'essai avec la ferrite Mn-Zn, où des cellules à forte concentration de Fe, marquées en vert et mises en évidence par les flèches dans la micrographie SEM représentative, ont été observées comme le montre la Fig. 1 (b). Ce scénario change en modifiant les nanoparticules avec le bio-NCP, où les cellules présentent une concentration de Fe plus faible après le dosage, comme illustré à la Fig. 1 (c). Suggérant ainsi que le revêtement bio-polymérique modifié avec nHAP inhibe la réaction des cellules de défense, qui est connue pour compromettre la fonction du support33.

Images SEM représentatives et analyses EDS de monocytes normaux d'un donneur sain (groupe témoin) (a) et des cellules après avoir été en contact pendant 2 h soit avec des nanoparticules de ferrite Mn-Zn (b) soit avec le bio-NCP (c). Des concentrations élevées en Fe, marquées en vert, suggèrent une absorption par les nanoparticules de ferrite Mn-Zn.

La figure 2 (a) présente des images SEM représentatives de groupes témoins de cellules cancéreuses du côlon (en haut) et du poumon (en bas), tandis que la figure 2 (bc) présente les cellules après 2 h de contact avec de la ferrite Mn-Zn et des nanoparticules bio-NCP, respectivement. Les cellules ont également été soumises à des analyses EDS, comme illustré par les points verts, qui sont plus évidents pour les cellules testées avec des nanoparticules de ferrite Mn-Zn pures, Fig. 2 (b).

Images SEM représentatives et analyses EDS d'analyses in vitro de cellules cancéreuses du côlon (HCT116) et du poumon (3LL) (contrôle) (a) et des cellules après 2 h de contact avec de la ferrite Mn-Zn (b) et bio-NCP (c ). Les points verts représentent des régions à forte concentration en Fe déterminée par EDS et les encarts présentent des images agrandies des régions sélectionnées. Les cellules cancéreuses du côlon présentent les changements morphologiques les plus évidents après contact avec la ferrite Mn-Zn et le bio-NCP.

De plus, dans chaque figure, les encarts montrent des images agrandies de zones sélectionnées pour mettre en évidence les changements morphologiques cellulaires. Ces changements ont été évalués en comparant la distribution du rapport d'aspect des cellules, qui fait référence au rapport entre le grand et le petit axe d'une ellipse décrivant la forme de chaque cellule, avant et après leur contact avec la ferrite Mn-Zn et le bio- Nanoparticules NCP. Sous ces lignes, les distributions de rapport d'aspect plus proches de 1 indiquent des cellules avec des formes principalement sphériques. Ces résultats sont présentés sur la figure 3. À partir de ces analyses, on obtient des rapports d'aspect moyens de 1,9 et 1,5 pour les groupes de contrôle du côlon et des poumons, respectivement. Fait intéressant, après le contact entre les cellules cancéreuses du côlon et la ferrite Mn-Zn et le bio-NCP, la distribution du rapport d'aspect des cellules a montré une diminution d'environ 26 %, atteignant une valeur moyenne de 1,4. Aucun changement détectable n'est détecté pour les cellules pulmonaires.

Distributions des rapports d'aspect représentées par des barres pour (a) les cellules de contrôle du cancer du côlon (HCT116) et du poumon (3LL) et pour les cellules après 2 h de contact avec (b) la ferrite Mn-Zn et (c) le bio-NCP. Les changements morphologiques, plus évidents dans les cellules cancéreuses du côlon après contact à la fois avec la ferrite Mn-Zn et le bio-NCP, se reflètent par des distributions plus nettes. Dans chaque figure, les symboles représentent la fréquence cumulée des rapports d'aspect.

Enfin, un test préliminaire de cytotoxicité des matériaux, dont le bio-NCP + PTX, sur des cellules saines a été fourni par des essais in-vitro avec des fibroblastes, adoptés ici comme modèle pour les cellules saines, suivant la recommandation donnée par la norme ISO 10 993-5 . Comme présenté sur la figure 4, la viabilité des fibroblastes après les tests ne présente aucune différence significative par rapport aux résultats obtenus pour le groupe témoin, indiquant aucune toxicité significative.

Test de viabilité sur fibroblaste après 24h en contact avec les nanoparticules de ferrite Mn-Zn, le bio-NCP et le complexe bio-NCP + PTX ne montrant pas de toxicité significative.

Notez que l'échantillon de contrôle est le fibroblaste sans contact avec aucun matériau.

Les spectres NEXAFS pour PTX et bio-NCP, présentés sur la Fig. 5(a), sont élargis par la convolution des excitations du fait de la grande flexibilité des liaisons carbone34. Néanmoins, l'empreinte PTX à 283,3 eV est clairement détectée et peut être liée à une liaison CC π*, caractéristique des cycles aromatiques. Un pic à 286 eV dans le spectre des bio-NCP peut être lié à une transition C1s → σ* sur les liaisons C-OH, tandis que la bande large à 291 eV est attribuée à l'excitation des liaisons C, H et N à partir des chitosane réticulé34. Le pic remarquable du spectre bio-NCP à 347 eV est lié au bord Ca L3,2 et indique la modification de l'apatite à la surface du chitosane35.

Spectres NEXAFS pour PTX et le bio-NCP (a). Le spectre PTX montre un pic caractéristique à 283 eV, tandis que le spectre bio-NCP montre des transitions caractéristiques à 286 eV, 291 eV et 347 eV. En (b), la carte de la composition chimique du bio-NCP + PTX obtenue par STXM après avoir effectué une décomposition en valeurs singulières sur des images collectées à l'aide de rayons X aux énergies suivantes : 275 eV, 283 eV, 286 eV, 300 eV, 320 eV et 347 eV. La PTX est représentée en jaune, le bio-NCP en rouge et la couleur bleue correspond aux matériaux de fond, dont les nanoparticules magnétiques. Les taches vertes indiquent les régions à faible concentration de PTX. La carte de composition montre la distribution du PTX dans la coque polymère nHAP.

La figure 5(b) présente la carte de composition chimique dérivée des données STXM. Sur cette carte, le PTX est représenté en jaune et le bio-NCP en rouge. La couleur bleue représente les matériaux de fond, y compris les nanoparticules magnétiques. Les taches vertes, un mélange de jaune et de bleu, dénotent des régions à faible concentration de PTX. L'image résultante montre que le médicament est distribué le long de la coque chitosan/nHAP avec les nanoparticules magnétiques de ferrite Mn-Zn formant le noyau du bio-nanocomposite. Cette distribution confirme l'encapsulation réussie du médicament.

Pour vérifier la récupération de PTX après exposition du bio-NCP + PTX dans des milieux aqueux pendant des temps plus longs, ce dernier a été dispersé dans de l'eau à 37 ° C (température du corps humain) pendant 7 jours, séché à température ambiante sous vide et étudié par FTIR. Toutes les caractéristiques spectrales spécifiques à l'échantillon dispersé, bio-NCP + PTX tel que préparé et pour le PTX pur sont comparées aux résultats des calculs DFT pour la molécule en phase gazeuse et discutées en détail dans les informations supplémentaires. Le résultat le plus frappant a été l'observation des modes situés à 1535 et 1550 cm−1, attribués aux cycles benzéniques. Ces modes sont récupérés après la libération du médicament et liés à l'activité anti-tumorale de PTX7.

Le point clé suivant pour élucider le processus de libération était l'analyse des interactions du médicament avec son support. Cette étape a été accomplie en combinant des expériences INS avec des calculs DFT sur la molécule libre. Des détails sur ces calculs, assistés par l'identification complète des caractéristiques vibrationnelles dans les spectres par des animations pour le médicament pur et encapsulé sont donnés dans les informations supplémentaires. Il est à noter que les calculs sont effectués dans l'approximation harmonique, alors que les modes vibrationnels de nos matériaux, en particulier les basses fréquences, sont susceptibles d'être des modes anharmoniques. La structure schématique de la molécule PTX adaptée de7 est également décrite dans les informations supplémentaires.

Sur la figure 6 (a), le maximum net autour de 56 cm−1 est lié au mode acoustique pour H2O36. Rappelons ici que la PTX utilisée dans ce travail est un mélange de formes hydratées et déshydratées37. Les modes supérieurs à 60 cm-1 sont attribués aux groupements acétyle et phényle dans la molécule de PTX ne sont pas détectés dans le spectre (bio-NCP + PTX-bio-NCP), qui correspond à celui de la molécule de PTX encapsulée. Cela indique que la molécule est sévèrement contrainte ou a adapté une nouvelle conformation. Cependant, il est également clair, comme le montrent les flèches, que certaines vibrations de fréquences plus élevées attribuées à la molécule PTX restent dans le spectre (bio-NCP + PTX-bio-NCP). Ces vibrations proviennent principalement des carbones du cycle terpénique lui-même ainsi que des mouvements du réseau, ce qui implique que la structure rigide de la PTX est maintenue même après l'encapsulation. Comme le montre la figure 6 (b), les vibrations méthyliques restantes sont également détectées entre 200 cm-1 et 270 cm-1, tandis que les modes au-dessus de 300 cm-1 semblent faibles en raison des mauvaises statistiques de la procédure de soustraction. Par conséquent, nous sommes amenés à conclure que la restriction des groupes acétyle et phényle est très probablement due au repliement de la molécule.

Données INS recueillies au FDS entre (a) 20 et 200 cm−1 et (b) entre 200 et 500 cm−1. Dans (a, b), la courbe noire montre les données PTX, tandis que la contribution du médicament encapsulé, représentée en jaune, est représentée par le spectre de différence entre les spectres (bio-NCP + PTX) et (bio-NCP). Les données bio-NCP ne sont pas présentées. Les spectres INS obtenus par calculs DFT pour la molécule libre sont représentés en vert. Dans le spectre de différence, les modes attribués aux groupes acétyle et phényle, observés en dessous de 80 cm-1, ne sont pas détectés, tandis que les vibrations du cycle terpénique, indiquées par des flèches, restent visibles dans la drogue encapsulée. Ceci indique que la mobilité des groupes biologiquement actifs de PTX est fortement contrainte.

Nos premiers essais in vitro montrent qu'aucun changement morphologique n'a été observé dans les monocytes après leur contact avec les nanoparticules de ferrite pure Mn-Zn ou avec le bio-NCP. Après contact avec la ferrite Mn-Zn, cependant, plusieurs monocytes présentaient une concentration élevée en Fe. Cette dernière observation indique une interaction et/ou une captation des nanoparticules magnétiques par les monocytes. Pendant ce temps, une très faible concentration de Fe a été détectée dans les tests effectués avec le bio-NCP, ce qui pourrait être, en principe, une conséquence de la concentration de Fe plus faible par rapport à la ferrite pure. Cependant, compte tenu de la mise en place de cette expérience, décrite dans la section Méthodes, il est plausible de considérer que le bio-NCP inhibe l'interaction/absorption des monocytes. D'autres essais in vitro effectués avec des cellules cancéreuses du côlon et du poumon indiquent que les nanoparticules de ferrite Mn-Zn et le bio-NCP interagissent et provoquent des changements morphologiques dans les cellules cancéreuses, en particulier celles du côlon. Cette hypothèse est tirée sur la base de la variation de la distribution des rapports d'aspect, qui était initialement caractéristique des cellules allongées et s'est rapprochée de celle décrivant les cellules sphériques après l'interaction. Même à un stade précoce, il s'agit d'un résultat encourageant, puisque le caractère invasif des lignées cellulaires du cancer du côlon a été associé à sa morphologie allongée38. De plus, comme la réponse observée pour les nanoparticules de ferrite Mn-Zn et le bio-NCP est très similaire, il est raisonnable de supposer que l'effet bio-NCP a son origine sur le noyau magnétique. En effet, les effets des nanoparticules à base de Fe sur les cellules cancéreuses, y compris celles du côlon, ont été attribués à des espèces réactives de l'oxygène (ROS) catalysées par Fe contrôlées qui déclenchent potentiellement l'autophagie et la mort cellulaire associée39,40. Par conséquent, cette observation semble suggérer que les ions Fe sont libérés à travers la coque polymère/apatite du bio-NCP au cours de cette expérience particulière. D'autre part, l'absence de toxicité pour les fibroblastes peut être liée à la réduction de la toxicité du Fe pour les cellules saines à de faibles concentrations de Fe41,42. Ces résultats sont motivants pour l'application du bio-NCP + PTX dans le traitement du cancer, car il semble être non toxique pour les cellules saines. Cependant, ces résultats suggèrent également que le médicament est soit à une très faible concentration dans le nanocomposite, soit qu'il n'est pas facilement libéré dans les conditions expérimentales du protocole choisi. Pour répondre à cette question, il est nécessaire d'étudier la concentration de PTX dans le bio-NCP. Une tâche pas du tout simple en raison de la complexité du bio-NCP + PTX, qui rend l'application des techniques les plus courantes, telles que la HPLC (chromatographie liquide à haute performance), difficile et crée la nécessité d'utiliser des semi-conducteurs plus sophistiqués. approches. Par conséquent, en combinant NEXAFS et STXM, une carte de la composition chimique a été obtenue pour le bio-NCP + PTX. Cette carte montre qu'une quantité importante de médicament est effectivement distribuée dans le chitosane et la coque nHAP, ce qui suggère que la libération lente de PTX est très probablement due à son confinement dans la matrice.

Cette dernière observation nous a pointé vers la nécessité de comprendre comment le confinement influence la dynamique PTX. Cette question a été répondue en combinant INS et DFT. La simplicité de l'interaction neutron-noyau et la section efficace de diffusion incohérente exceptionnellement élevée de l'atome d'hydrogène par rapport à celle de tout autre élément étaient essentielles à une telle compréhension43. De cette analyse, nous avons conclu que la mobilité des groupes biologiquement actifs de PTX, c'est-à-dire les groupes acétyle et phényle, est fortement limitée dans le bio-NCP + PTX. Par conséquent, on peut émettre l'hypothèse que le transporteur limite l'activité de la PTX non seulement en tant que barrière physique entre le médicament et les sites d'action, mais également en limitant les mouvements sur des parties spécifiques de la molécule. Cependant, après libération, ces mouvements vibratoires ont été partiellement récupérés, comme observé au moyen de FTIR, indiquant que l'agent anticancéreux pourrait retrouver sa forme active.

D'après les résultats de viabilité et d'INS, il est maintenant clair qu'avant d'envisager de futures applications du bio-NCP + PTX dans des essais in vivo, le taux de libération du médicament doit être mieux contrôlé. Une approche évidente pour contourner le problème serait la modification de la structure du bio-NCP, c'est-à-dire le degré de réticulation et de mimétisation par rapport au chitosane, voire le choix d'un autre polymère avec une répartition de charge de surface différente, comme le polyéthylène glycol44 . Néanmoins, avant de progresser dans cette direction, quelques questions doivent être approfondies, telles que l'évaluation du comportement de libération de PTX à partir du bio-NCP dans l'environnement des cellules cancéreuses. L'environnement inhérent au pH légèrement inférieur à celui des cellules saines pourrait suffire à dégrader ou détendre le réseau de chitosane45,46. De plus, l'utilisation de la radiofréquence comme autre possibilité devrait être étudiée. Dans ce cas, en chauffant les nanoparticules magnétiques27, le réseau polymère peut être relâché et, à son tour, la libération du médicament pourrait être facilitée.

En conclusion, nous rapportons des résultats encourageants sur l'application d'un nouveau bio-NCP en tant que porteur de PTX. Nous proposons également de nouvelles méthodologies pour l'étude des médicaments encapsulés, basées sur des techniques de diffusion de pointe combinées à des calculs théoriques. Les prochaines étapes de ce travail se concentreront sur une meilleure compréhension des effets de l'encapsulation sur la dynamique de la PTX libérée et sa corrélation avec son activité biologique ainsi que sur l'optimisation du mécanisme de libération du médicament.

Le processus de synthèse détaillé pour obtenir le bio-NCP est décrit ailleurs28. Brièvement, à partir des résultats de diffraction des neutrons28, nous avons déterminé que 0,41 mg de Fe par mg de nanoparticules ont été précipités à partir d'une solution de sels et ensuite encapsulés dans du chitosane par la méthode de la double émulsion. Le chitosane a ensuite été réticulé par réaction avec du glutaraldéhyde et un processus de mimétisation final a été effectué pour modifier la surface avec de l'apatite formant le nanocomposite bio-NCP. En fonction de l'efficacité de mimétisation, difficilement déterminable car liée à la quantité d'apatite effectivement présente à la surface du polymère, dans le bio-NCP final la quantité de Fe par mg peut varier entre 0,20 mg (100% d'efficacité) à 0,27 mg (0 % d'efficacité). Le bio-NCP + PTX a été produit par une méthode similaire qui comprenait l'ajout de PTX à la solution avant la réticulation du chitosane. Par conséquent, nous pouvons supposer que la quantité de Fe contenu est le bio-NCP + PTX est similaire. De plus amples détails sont donnés dans les informations complémentaires.

Des monocytes humains ont été isolés du sang périphérique de donneurs sains conformément à la Déclaration d'Helsinki. Tous les volontaires sains ont donné leur consentement éclairé. L'étude a été approuvée par le Comité d'éthique de la recherche en santé, Plataforma Brasil (http://aplicacao.saude.gov.br/plataformabrasil/login.jsf), avec le numéro de décision 1358038 et le numéro CAAE 50995715.9.0000.5411. Des lignées stables de cellules cancéreuses, fournies par le laboratoire du Dr Kaneno, ont été utilisées. Ainsi, aucune approbation du comité d'éthique local n'était nécessaire. Les processus détaillés impliqués dans la préparation des cultures cellulaires sont décrits dans les informations supplémentaires. Après préparation, les cellules ont été fixées à 2 × 105 cellules/mL et distribuées sur des lames de verre bombées (∅13 mm), préalablement enduites de poly-L-lysine. Pour favoriser la fixation des cellules sur les lames, les cultures ont été maintenues pendant 2 h à 37 °C sous 5 % de CO2.

Les lames de verre ont été lavées trois fois avec un milieu de culture complet chaud (décrit dans les informations supplémentaires) (1 ml à chaque fois) et laissées interagir avec 50 μg de ferrite pure ou de nanoparticules bio-NCP. Les cultures cellulaires ont été maintenues pendant 2 h à 37 ° C sous 5 % de CO2 pour permettre un contact direct entre les surfaces cellulaires et les nanoparticules. Les lames ont ensuite été lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) fraîche à température ambiante, les monocouches cellulaires fixées avec du glutaraldéhyde à 2,5% et traitées de manière routinière pour une analyse par microscopie comme suit.

Après fixation des monocouches sur les lames, les cellules ont été déshydratées avec des solutions d'éthanol à 7,5, 15, 30, 50, 70, 90 et 100 %, deux fois en 10 min pour chaque concentration d'alcool et soumises à un séchage supercritique (au-dessus du point critique ) dans une atmosphère de CO2 pour une métallisation supplémentaire. Les échantillons ont ensuite été analysés par microscopie électronique à balayage (SEM) (FEI, Quanta 200 équipé d'un Oxford, Inca, 250P20 EDS) et 7 images (grossissement 1000 ×) ont été recueillies au hasard pour chaque lame. Les distributions du rapport d'aspect des cellules ont été évaluées avec le logiciel ImagePro 4.1.0.0. Aucune étude n'a été menée pour déterminer le nombre de cellules ; par conséquent, les comptages de cellules ont été normalisés à la valeur maximale. EDS a été utilisé pour cartographier la concentration de Fe sur les cellules. La quantité de nanoparticules, ainsi que les paramètres de l'instrument ont été réglés pour fournir le même rapport signal/bruit pour une même masse de ferrite Mn-Zn ou de bio-NCP.

La toxicité de la ferrite pure, du bio-NCP et du bio-NCP + PTX a été évaluée par rapport aux fibroblastes Balb/c 3T3 (clone A31 – American Type Culture Collection) comme suit. Dans un premier temps, les cellules ont été traitées comme décrit dans les informations complémentaires, réparties dans des plaques 96 puits contenant chacune 5 × 104 cellules et maintenues en culture pendant 24 h. Par la suite, 50 μg de chaque échantillon, c'est-à-dire ferrite pure, bio-NCP et bio-NCP + PTX, ont été mis en suspension dans le même milieu de culture utilisé pour cultiver les cellules et ajoutés aux plaques permettant leur interaction avec les cellules. Après 24 h, le surnageant, c'est-à-dire l'excès de nanoparticules liquides et magnétiques, a été éliminé, les cellules lavées avec du PBS-A et soumises à une incubation avec du 3-[4,5-diméthylthiazol-2-yl]-2,5-diphényltétrazolium bromure (MTT) avec 0,5 mg de MTT/mL de DMEM pendant 4 heures. Cela a entraîné la formation du colorant formazan dans les cellules vivantes, qui a été solubilisé dans du DMSO et quantifié à l'aide d'un photomètre à microplaque par lecture à 570 nm. Les valeurs d'absorbance obtenues reflètent la viabilité des cellules. Les expériences ont été réalisées en double avec an = 6 chacune.

Des échantillons de PTX et de bio-NCP ont été dispersés dans de l'éthanol pour être déposés sur des membranes de nitrure de silicium (Silson, Angleterre) et placés dans un environnement à faible vide pour une analyse aux rayons X en utilisant la plage d'énergie des photons du bord K du carbone (250 à 350 eV) à la ligne de faisceau PolLux (Swiss Light Source à l'Institut Paul Scherrer, Suisse)47,48,49. Pour les expériences STXM, un faisceau de rayons X monochromatique est focalisé sur l'échantillon et l'intensité transmise mesurée est utilisée pour construire une image pixel par pixel. Lors du réglage de l'énergie des photons des rayons X sur les caractéristiques de résonance présentes dans le spectre NEXAFS, les images STXM afficheront des caractéristiques fortes liées au contraste naturel basé sur la liaison moléculaire des matériaux constitutifs. Ainsi, en combinant un ensemble d'images obtenues à des énergies photoniques sélectionnées avec les spectres NEXAFS des matériaux composants, la carte de composition chimique de l'échantillon est calculée à l'aide de la décomposition en valeurs singulières50. Par conséquent, après la collecte des spectres NEXAFS du PTX et du bio-NCP, des images STXM pour le bio-NCP + PTX ont été obtenues à des énergies de rayons X de : 275 eV, 283 eV, 286 eV, 300 eV, 320 eV et 347 eV. Les images et les spectres ont été analysés à l'aide du progiciel aXis200051.

La dynamique vibrationnelle de PTX, bio-NCP et bio-NCP + PTX a été étudiée au moyen de la spectroscopie neutronique à l'aide du spectromètre FDS au Lujan Center du Los Alamos National Laboratory (USA) à 10 K. En utilisant ce spectromètre, il a été possible pour observer des mouvements moléculaires entre 50 et 500 cm−1. Les échantillons ont été montés dans des conteneurs en aluminium scellés et une analyse au vanadium a été utilisée pour corriger les données.

L'optimisation structurelle de la molécule de paclitaxel en phase gazeuse à 0 K et le calcul ultérieur des fréquences vibrationnelles harmoniques ont été effectués au niveau théorique B3LYP / 6-31 + G (d ') à l'aide de Gaussian0952. Les positions atomiques de départ ont été tirées de la structure cristalline du 2-carbamate taxol, décrite dans la réf. 53. Les fréquences et les amplitudes vibrationnelles du calcul gaussien ont ensuite été utilisées pour calculer les intensités et les spectres vibrationnels des spectres de diffusion inélastique des neutrons à l'aide du programme a_climax54. Le spectre FTIR pour le PTX a également été calculé et utilisé pour l'attribution de mode dans la plage de 1400 à 1900 cm−1.

Comment citer cet article : Martins, ML et al. La mobilité restreinte de groupes fonctionnels spécifiques réduit l'activité des médicaments anticancéreux dans les cellules saines. Sci. Rep. 6, 22478; doi : 10.1038/srep22478 (2016).

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Ce travail a bénéficié de l'utilisation du Manuel Lujan, Jr. Neutron Scattering Center du Laboratoire national de Los Alamos et du financement du Bureau des sciences énergétiques fondamentales du Département de l'énergie. Le Laboratoire national de Los Alamos (LANL) est exploité par Los Alamos National Security LLC dans le cadre du contrat DOE DE-AC52-06NA25396. MLM et RI remercient la source lumineuse suisse pour le temps de faisceau à PolLux, qui est financé par le ministère allemand de la Bildung und Forschung (BMBF) par le biais des contrats 05KS4WE1/6 et 05KS7WE1. Les auteurs remercient FAPESP, CNPq et DANSCATT pour le soutien financier. JE tient à remercier le groupe de physique et de chimie des matériaux (T-1) du LANL pour la mise à disposition des ressources informatiques et le Dr Jernej Stare pour avoir effectué certains calculs à l'Institut national de chimie de Ljubljana, en Slovénie. Le Dr Walter Kalceff (UTS, Australie) est également remercié pour l'examen critique et les discussions de ce travail.

Institut Niels Bohr, Université de Copenhague, DK-2100, Copenhague, Danemark

Murillo L. Martins, Rosanna Ignazzi & Heloisa N. Bordallo

Institut des biosciences - Université d'État de Paulista - CP 510, 18618-970, Botucatu – SP, Brésil

Murillo L. Martins, Ramon Kaneno, Willian F. Zambuzzi et Margaret J. Saeki

Département de chimie, Université de Floride du Sud, 4202 E. Fowler Ave., Tampa, 33620, Floride, États-Unis d'Amérique

Jürgen Eckert

Laboratoire national de Los Alamos, Los Alamos, 87545, Nouveau-Mexique, États-Unis d'Amérique

Juergen Eckert et Luke Daemen

Source de Lumière Suisse, Institut Paul Scherrer, CH-5232, Villigen, Suisse

Benjamin Watts

Source européenne de spallation ESS AB, PO Box 176, SE-221 00, Lund, Suède

Heloisa N. Bordallo

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MLM et HNB ont participé à la conception des expériences, à l'analyse des données et à la rédaction du manuscrit. MLM, RI, BW, RK, WFZ, LD et MJS ont réalisé les expériences et la réduction des données. JE a fourni son expertise avec les calculs DFT. Ce manuscrit a été approuvé par tous les co-auteurs dans sa version actuelle.

Les auteurs déclarent une absence d'intérêts financiers en compétition.

Ce travail est sous licence internationale Creative Commons Attribution 4.0. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans la ligne de crédit ; si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons, les utilisateurs devront obtenir l'autorisation du titulaire de la licence pour reproduire le matériel. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Réimpressions et autorisations

Martins, M., Ignazzi, R., Eckert, J. et al. La mobilité restreinte de groupes fonctionnels spécifiques réduit l'activité des médicaments anticancéreux dans les cellules saines. Sci Rep 6, 22478 (2016). https://doi.org/10.1038/srep22478

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Reçu : 29 juin 2015

Accepté : 08 février 2016

Publié: 02 mars 2016

DOI : https://doi.org/10.1038/srep22478

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